探针引物设计(探针引物设计 培训班)

引物的设计要求

1、引物设计的要求：●避免重复碱基，尤其是G.●Tm=58-60度。●GC=30-80%.●3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.●正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

2、引物设计原则：长度： 18~30 bp， 20 bp左右最为常用。引物过短易导致非特异性打增；较长引物特异性强，但退火效率低，且易形成二级结构，从而导致PCR产量少。

3、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。

4、① 特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。② 引物长度： 一般在15~30碱基之间 ，引物有效长度Ln=2（G+C）+A+T，Ln值不能大于38。

5、因此，如果想提高PCR反应的特异性，可以将引物的Tm设计得高一点，这样就可以把PCR的退火温度相应设定得高一点。

6、PCR引物设计的11条要求 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

如何进行引物设计?

1、特异性：引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性，不应有连续8个碱基与待扩增区外序列完全互补。可对其进行BLAST检测进行验证。

2、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

3、避免二聚体和自身互补：设计引物时需要避免两个引物之间形成二聚体或自身互补，这会影响PCR效率和特异性。 进行特异性检测：使用软件工具进行特异性检测，以确保所选引物只扩增目标DNA序列而不扩增其他非特异性DNA。

4、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

5、端避免使用 碱基 A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个 外显子 。Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

引物设计和探针设计有什么区别

引物是用来扩增片段用的，而探针，探针上面有荧光基团，完整时检测不到荧光，与两引物之间的目的基因结合，PCR扩增过程中，探针被切断，可以检测到荧光。

探针和引物的区别：两者的用途不同：引物设计的用途：用于PCR扩增技术。探针设计的用途：用于标记待定的核苷酸片断，用与特异性地、定量地检测核酸的量。

如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。

只要是符合要求的DNA片段都可以用来做探针和引物，探针和引物是两个完全不同的概念，他们都是DNA或者RNA，只是用的方法不一样。

引物和探针本质都是寡聚核苷酸也就是Oligo，无非就是使用的目的不同。不知道靶序列，当然就不能得到对应的特异性探针，除非你根据同源序列设计可能的探针。

要高。探针的Tm值在67~72℃之间，要比引物的Tm值高8~10℃，为保证在退火时探针先于引物与目的片段结合，所以温度要高于引物。探针最好是富含GC的保守片段，确保其的Tm值较高。